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19/08/2017
PCR en Tiempo Real: uso de un control interno.
El PCR en Tiempo Real (qPCR) ha llegado a ser una de los métodos de diagnóstico mas ampliamente utilizados en el mundo, debido a su alta sensibilidad y el corto tiempo en la obtención de resultados.
23/02/2010


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PCR en Tiempo Real: uso de un control interno.

Respecto de la sensibilidad, alguno de los parámetros críticos que determinan una baja en la sensibilidad es la baja calidad yo cantidad del ácido nucleico (RNA o DNA); diferencias en la eficiencia de la transcripción reversa; diferencias en la eficiencia del PCR intercorrida; errores del operador; y por {ultimo presencia de inhibidores del PCR. Estos factores inevitablemente producirán un ?ruido? en la señal de fluorescencia, por lo que los esfuerzos en la estandarización de cualquier PCR tenderán a minimizarlos. La figura 1 resume estos factores.

 

Una de las vías para minimizar estos efectos es el uso de la normalización de un gen de referencia interno (llamado también control interno). Esto funciona, eso sí, bajo la premisa que los niveles de expresión del gen son constantes, independiente de las condiciones experimentales. Por lo tanto, la diferencia de expresión del gen de referencia entre muestras representa las diferencias experimentales introducidas, desde el material de inicio a los diversos pasos del qPCR.

 

Sin embargo, el uso de este gen de referencia debe ser validado para un ensayo diagnóstico en particular, significando una alta variabilidad en los datos y finalmente resultados erróneos.

 

Pasos en la validación

 

1)         Selección del gen de referencia. Normalmente este gen debe expresarse constitutivamente en la célula, es decir, la expresión no debe variar mayormente bajo distintas condiciones externas. La mayoría está relacionado con vias biosintéticas particulares (como el gen de la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (GDPH)) o algún gen de un factor de elongación (como el Factor de Elongación 1alfa ELF1a).

 

2)         Estandarización de las condiciones del PCR. Para este paso se requieren que ambas sondas - una que hibride en el gen blanco y la otra en el gen de referencia, marcadas con fluoróforos distintos ? tengan Tms similares. Además, importante es que la eficiencia del PCR para el gen blanco no se vea afectada por el PCR del gen interno de referencia. Esto último trae como consecuencia que la sensibilidad de nuestro PCR baje notoriamente. Este es un punto crítico a la hora de elegir un buen control interno.

 

Finalmente, el uso de un control interno permitirá al laboratorio poder descartar una serie de factores externos al qPCR que afectan la sensibilidad y que pueden provocar que muestras clínicas positivas sean diagnosticadas como falsos negativos.

 

 

Andrés Araya, Ph.D.

Roche Diagnostics Chile 

Mayor información en www.roche-applied-science.com



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