Lunes
20/11/2017
Liderando la criopreservación en Sudamérica
La Criopreservación es el proceso mediante el cual se pueden congelar células o tejidos en nitrógeno líquido a bajas temperaturas con la finalidad de detener sus funciones vitales y de esta manera mantenerlo en condiciones de vida suspendida por años.
28/01/2009


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Liderando la criopreservación en Sudamérica

La criopreservación o la preservación de células en nitrógeno líquido no es una tarea sencilla  y requiere de diversos estudios que permitan asegurar la calidad del material preservado, más aún en un tema tan innovador y prometedor para el sector acuícola. Es precisamente este tópico el que se está trabajando en la Universidad Católica del Norte (Chile), en este caso, la criopreservación de  material genético (espermatozoides) de moluscos de importancia comercial.


La población de moluscos en las costas de de todo el mundo han disminuido. Sin embargo, la acuicultura permite que ciertas especies se mantengan en el tiempo, pese a que la variabilidad genética de estos individuos se va haciendo menor, lo cual genera ciertos riesgos. Esta disminución,  puede ser corregida incorporando nuevos individuos proveniente de poblaciones silvestres o de otros cultivos.   Los organismos portadores de genes con mayor variabilidad y características fenotípicas deseadas, se transforman en reproductores y sus gametos son utilizados  para fecundar.


La criopreservación es el respaldo al material genético y un resguardo de toda la tarea de selección realizada, una manera de asegurar  la investigación y las líneas genéticas logradas por los investigadores. Es por esto  que la Universidad Católica del Norte (UCN) ha puesto todo su esfuerzo trabajando en el primer banco de germoplasma de Sudamérica. Esto a través del  proyecto  ?Investigación y desarrollo de un banco crio-biotecnológico para  especies marinas de importancia comercial?, liderado por  Enrique Dupré, director general del proyecto  y profesor asociado de la UCN, Coquimbo.


Dicho proyecto se inició en enero de 2007,  se prolongó a lo largo de todo el año 2008 y terminará  en junio de 2009, fecha en que tendrán el protocolo de criopreservación de cuatro especies de moluscos de importancia comercial: abalón japonés, abalón californiano, ostión del norte y macha. ?Básicamente lo que pretendemos aquí, es determinar un  protocolo de criopreservación para las diferentes especies. 


En una primera etapa había que determinar la toxicidad de los crioprotectores, luego, identificar la concentración de cada uno de éstos, dependiendo de la especie y, finalmente, el tiempo de permanencia del crioprotector dentro de la célula, en una segunda etapa se debe determinar la tasa con que se debe disminuir la temperatura para congelar en nitrógeno líquido y luego el modo de descongelar y obtener espermatozoides capaces de fecundar ovocitos frescos en altos porcentajes?, puntualiza el profesor Dupré.

El crioprotector

Para llevar a cabo la criopreservación se necesita un compuesto químico que permita proteger a las células del daño provocado por la congelación.  Este crioprotector puede o no  penetrar la célula a través de la membrana plasmática. Existen distintos crioprotectores, ?el crioprotector es específico para cada célula?, expresa Dupré, y la selección del apropiado es de gran importancia para la criopreservación, ya que cada uno de ellos originará efectos diferentes en las especies tratadas y, por lo tanto, diferentes tasas de mortalidad.


Según los estudios realizados en la UCN, Enrique Dupré expresó que: ?durante el primer año se probaron distintos crioprotectores y su  toxicidad; finalmente nos  quedamos con tres, que   fueron los que  causaban menor daño genómico (rompimiento de DNA) y lograban mantener  la motilidad espermática, estos son: Dimetilsulfóxido (DMSO), propilén-glicol y etilen-glicol EG ?.


Sin embargo la investigación continúa, ya que diferentes especies requieren distintos crioprotectores, distintas concentraciones y diferentes tiempos de permanencia, dentro de la célula, para provocar  el menor daño posible. Renard y Cochard, 1989, en un estudio realizado en  Crassostrea gigas, expresaron la importancia del crioprotector e indicaron que ?cada especie responde de distinta manera a estos crioprotectores, originando diferentes efectos sobre los organismos al aplicar las mismas metodologías?. Sin embargo, las principales características a tener en cuenta son:


 1) Las características físico-químicas de la membrana plasmática de cada especie y a la  permeabilidad de la membrana frente a dicho compuesto.


 2) La toxicidad que el crioprotector produce una vez que ha penetrado en la membrana.

Elección del crioprotector

La elección se realiza evaluando la toxicidad de los crioprotectores,  determinando la motilidad espermática.  Este último aspecto lo trabajan en la UCN con un programa (image proplus), a través de la filmación. ?Nosotros filmábamos 5 segundos los espermatozoides sometidos a cada crioprotector y luego determinábamos la distancia que recorría, la  velocidad y su motilidad?, explica Dupré.  El especialista agrega que ?si  el espermio se desplazaba, quería decir que el flagelo estaba en condiciones, entonces íbamos variando el crioprotector y la velocidad iba cambiando.  Luego determinamos las cantidades óptimas y el tiempo de equilibrio (tiempo que los espermatozoides debían estar en esta solución)?.

Mezcla de  crioprotectores

Existen dos tipos de crioprotectores: los que penetran la célula y los que no.  Los primeros, son de bajo peso molecular (moléculas chicas) y tienen la capacidad de atravesar  la membrana plasmática.  En tanto,  los que no penetran son moléculas más grandes y no atraviesan la membrana plasmática.


Los crioprotectores que penetran la célula  reemplazan el agua, es decir,  entra el crioprotector y sale agua. El no penetrante, en cambio, evita el arrugamiento excesivo de la membrana  plasmática, que ocurre cuando entra crioprotector y sale agua, ya que las velocidades son distintas (sale más rápido el agua). Por lo tanto, en criopreservación, se utiliza una mezcla se crioprotectores penetrantes y no penetrantes.


Congelación

La segunda etapa consiste en determinar  la velocidad  de congelación de los espermios. La congelación puede ser rápida o lenta y de esto va a depender también la velocidad de descongelación. ?Partiendo desde la temperatura ambiente, llegamos a los -5ºC, con diferentes tasas de congelación que varían entre -5ºC/min hasta -35ºC/min. Luego, continuamos hasta llegar a los -80ºC y, finalmente, se preserva el material genético (espermatozoides)  a -196ºC en Nitrógeno líquido.


Durante este proceso se debe establecer la mejor tasa de congelación, lo cual se traduce en generar la menor cantidad de hielo intracelular y principalmente que forme  pequeños cristales  evitando que crezcan y rompan las membranas de la célula. Se deben emplear diferentes tasas de congelación entre temperatura ambiente y los -5ºC y entre los -5ºC y los -80ºC.


La duración total de la congelación varia entre 10 y 45 minutos dependiendo de la tasas de congelación utilizada. En estas congelaciones se utilizan pajuelas de 0,5 mL para contener las muestras de espermios.  Sin embargo, se están realizando ensayos con criotubos de 1.5 ml.

El material tratado, pasa posteriormente a la cámara de congelación que es la unidad que permite criopreservar la muestra biológica por largo tiempo, a través de la congelación, preservando al mismo tiempo su viabilidad. Consta de un sistema controlado por computador que  controla el grado de congelación del vapor de nitrógeno para evitar el deterioro de la célula por fenómenos osmóticos o por la cristalización del agua.

El material preservado puede permanecer hasta 13 mil años, explica Dupré quien, además, explica que ?se calculó que por efecto de la radiación UV, a los 13 mil años habría destrucción del material genético irrecuperable.  Existen enzimas que reparan el DNA, pero a los 13 mil años sería irreparable?.

Descongelación

Después del congelamiento el material preservado se debe descongelar para ser utilizado en fecundaciones in vitro. La velocidad de descongelación es muy importante, según, explica el investigador. ?Si se congela rápido necesita un descongelamiento rápido y si es lenta la descongelación debe ser lenta también.  Sin embargo, según nuestras investigaciones, hemos determinado que la descongelación rápida genera mejores resultados?, acota Dupré.

Después de descongelar los espermatozoides, se debe eliminar el crioprotector mediante dilución con agua de mar o agua dulce según la especies en estudio. La dilución no puede ser muy rápida ya que empieza a entrar agua a la célula y ésta se hincha y se rompe, lo que involucra un desastre  y la anulación de todo el trabajo realizado anteriormente.

La evaluación final de esta técnica se realiza  a través de la motilidad espermática y porcentaje de fecundación obtenido con ovocitos frescos.

?Actualmente tenemos espermatozoides congelados de las 4 especies de moluscos (abalón japonés, abalón californiano, ostión del norte y macha) con porcentajes  de fecundación entre el 40 y 87%.  En este momento estamos tratando de patentar tanto el protocolo de congelación-descongelación como el procedimiento para fecundar con espermatozoides criopreservados. Estamos trabajando a nivel piloto y estamos haciendo fecundaciones en las empresas asociadas.  Las empresas que deseen adoptar la tecnología podrán guardar su material genético  en la UCN, y nosotros tenemos que dar la garantía que lo que eso involucra?, enfatizó Dupré.

Posteriormente este trabajo podría continuar en otras especies como salmónidos, donde existe amplio trabajo de líneas genéticas en nuestro país, ya que la criopreservación es la herramienta del futuro para la genética. Ello porque permite ahorro en los costos de mantención de los reproductores, permite realizar fecundaciones en cualquier momento del año (independiente de la época reproductiva). Además, permite la preservación del material genético por largos periodos sin disminución de su viabilidad, el uso de la totalidad de los espermatozoides disponibles, reducción del  riesgo de transmisión de infecciones y la posible producción de híbridos con características deseables para los cultivos. Junto con esto, evita el envejecimiento de los gametos y permite la conservación de la variabilidad genética para poblaciones domesticadas y especies en peligro.  

La criopreservación o la preservación de células en nitrógeno líquido no es una tarea sencilla  y requiere de diversos estudios que permitan asegurar la calidad del material preservado, más aún en un tema tan innovador y prometedor para el sector acuícola. Es precisamente este tópico el que se está trabajando en la Universidad Católica del Norte, en este caso, la criopreservación de  material genético (espermatozoides) de moluscos de importancia comercial.

La población de moluscos en las costas de de todo el mundo han disminuido. Sin embargo, la acuicultura permite que ciertas especies se mantengan en el tiempo, pese a que la variabilidad genética de estos individuos se va haciendo menor, lo cual genera ciertos riesgos. Esta disminución,  puede ser corregida incorporando nuevos individuos proveniente de poblaciones silvestres o de otros cultivos.   Los organismos portadores de genes con mayor variabilidad y características fenotípicas deseadas, se transforman en reproductores y sus gametos son utilizados  para fecundar.

La criopreservación es el respaldo al material genético y un resguardo de toda la tarea de selección realizada, una manera de asegurar  la investigación y las líneas genéticas logradas por los investigadores. Es por esto  que la Universidad Católica del Norte (UCN) ha puesto todo su esfuerzo trabajando en el primer banco de germoplasma de Sudamérica. Esto a través del  proyecto  ?Investigación y desarrollo de un banco crio-biotecnológico para  especies marinas de importancia comercial?, liderado por  Enrique Dupré, director general del proyecto  y profesor asociado de la UCN, Coquimbo.

Dicho proyecto se inició en enero de 2007,  se prolongó a lo largo de todo el año 2008 y terminará  en junio de 2009, fecha en que tendrán el protocolo de criopreservación de cuatro especies de moluscos de importancia comercial: abalón japonés, abalón californiano, ostión del norte y macha. ?Básicamente lo que pretendemos aquí, es determinar un  protocolo de criopreservación para las diferentes especies.  En una primera etapa había que determinar la toxicidad de los crioprotectores, luego, identificar la concentración de cada uno de éstos, dependiendo de la especie y, finalmente, el tiempo de permanencia del crioprotector dentro de la célula, en una segunda etapa se debe determinar la tasa con que se debe disminuir la temperatura para congelar en nitrógeno líquido y luego el modo de descongelar y obtener espermatozoides capaces de fecundar ovocitos frescos en altos porcentajes?, puntualiza el profesor Dupré.

El crioprotector

Para llevar a cabo la criopreservación se necesita un compuesto químico que permita proteger a las células del daño provocado por la congelación.  Este crioprotector puede o no  penetrar la célula a través de la membrana plasmática. Existen distintos crioprotectores, ?el crioprotector es específico para cada célula?, expresa Dupré, y la selección del apropiado es de gran importancia para la criopreservación, ya que cada uno de ellos originará efectos diferentes en las especies tratadas y, por lo tanto, diferentes tasas de mortalidad.

Según los estudios realizados en la UCN, Enrique Dupré expresó que: ?durante el primer año se probaron distintos crioprotectores y su  toxicidad; finalmente nos  quedamos con tres, que   fueron los que  causaban menor daño genómico (rompimiento de DNA) y lograban mantener  la motilidad espermática, estos son: Dimetilsulfóxido (DMSO), propilén-glicol y etilen-glicol EG ?.

Sin embargo la investigación continúa, ya que diferentes especies requieren distintos crioprotectores, distintas concentraciones y diferentes tiempos de permanencia, dentro de la célula, para provocar  el menor daño posible. Renard y Cochard, 1989, en un estudio realizado en  Crassostrea gigas, expresaron la importancia del crioprotector e indicaron que ?cada especie responde de distinta manera a estos crioprotectores, originando diferentes efectos sobre los organismos al aplicar las mismas metodologías?. Sin embargo, las principales características a tener en cuenta son:

 1) Las características físico-químicas de la membrana plasmática de cada especie y a la  permeabilidad de la membrana frente a dicho compuesto.

 2) La toxicidad que el crioprotector produce una vez que ha penetrado en la membrana.

Elección del crioprotector

La elección se realiza evaluando la toxicidad de los crioprotectores,  determinando la motilidad espermática.  Este último aspecto lo trabajan en la UCN con un programa (image proplus), a través de la filmación. ?Nosotros filmábamos 5 segundos los espermatozoides sometidos a cada crioprotector y luego determinábamos la distancia que recorría, la  velocidad y su motilidad?, explica Dupré.  El especialista agrega que ?si  el espermio se desplazaba, quería decir que el flagelo estaba en condiciones, entonces íbamos variando el crioprotector y la velocidad iba cambiando.  Luego determinamos las cantidades óptimas y el tiempo de equilibrio (tiempo que los espermatozoides debían estar en esta solución)?.

Mezcla de  crioprotectores

Existen dos tipos de crioprotectores: los que penetran la célula y los que no.  Los primeros, son de bajo peso molecular (moléculas chicas) y tienen la capacidad de atravesar  la membrana plasmática.  En tanto,  los que no penetran son moléculas más grandes y no atraviesan la membrana plasmática.

Los crioprotectores que penetran la célula  reemplazan el agua, es decir,  entra el crioprotector y sale agua. El no penetrante, en cambio, evita el arrugamiento excesivo de la membrana  plasmática, que ocurre cuando entra crioprotector y sale agua, ya que las velocidades son distintas (sale más rápido el agua). Por lo tanto, en criopreservación, se utiliza una mezcla se crioprotectores penetrantes y no penetrantes.

Congelación

La segunda etapa consiste en determinar  la velocidad  de congelación de los espermios. La congelación puede ser rápida o lenta y de esto va a depender también la velocidad de descongelación. ?Partiendo desde la temperatura ambiente, llegamos a los -5ºC, con diferentes tasas de congelación que varían entre -5ºC/min hasta -35ºC/min. Luego, continuamos hasta llegar a los -80ºC y, finalmente, se preserva el material genético (espermatozoides)  a -196ºC en Nitrógeno líquido. Durante este proceso se debe establecer la mejor tasa de congelación, lo cual se traduce en generar la menor cantidad de hielo intracelular y principalmente que forme  pequeños cristales  evitando que crezcan y rompan las membranas de la célula. Se deben emplear diferentes tasas de congelación entre temperatura ambiente y los -5ºC y entre los -5ºC y los -80ºC.

La duración total de la congelación varia entre 10 y 45 minutos dependiendo de la tasas de congelación utilizada. En estas congelaciones se utilizan pajuelas de 0,5 mL para contener las muestras de espermios.  Sin embargo, se están realizando ensayos con criotubos de 1.5 ml.

El material tratado, pasa posteriormente a la cámara de congelación que es la unidad que permite criopreservar la muestra biológica por largo tiempo, a través de la congelación, preservando al mismo tiempo su viabilidad. Consta de un sistema controlado por computador que  controla el grado de congelación del vapor de nitrógeno para evitar el deterioro de la célula por fenómenos osmóticos o por la cristalización del agua.

El material preservado puede permanecer hasta 13 mil años, explica Dupré quien, además, explica que ?se calculó que por efecto de la radiación UV, a los 13 mil años habría destrucción del material genético irrecuperable.  Existen enzimas que reparan el DNA, pero a los 13 mil años sería irreparable?.

Descongelación

Después del congelamiento el material preservado se debe descongelar para ser utilizado en fecundaciones in vitro.

La velocidad de descongelación es muy importante, según, explica el investigador. ?Si se congela rápido necesita un descongelamiento rápido y si es lenta la descongelación debe ser lenta también.  Sin embargo, según nuestras investigaciones, hemos determinado que la descongelación rápida genera mejores resultados?, acota Dupré.

Después de descongelar los espermatozoides, se debe eliminar el crioprotector mediante dilución con agua de mar o agua dulce según la especies en estudio. La dilución no puede ser muy rápida ya que empieza a entrar agua a la célula y ésta se hincha y se rompe, lo que involucra un desastre  y la anulación de todo el trabajo realizado anteriormente.

La evaluación final de esta técnica se realiza  a través de la motilidad espermática y porcentaje de fecundación obtenido con ovocitos frescos.

?Actualmente tenemos espermatozoides congelados de las 4 especies de moluscos (abalón japonés, abalón californiano, ostión del norte y macha) con porcentajes  de fecundación entre el 40 y 87%.  En este momento estamos tratando de patentar tanto el protocolo de congelación-descongelación como el procedimiento para fecundar con espermatozoides criopreservados. Estamos trabajando a nivel piloto y estamos haciendo fecundaciones en las empresas asociadas.  Las empresas que deseen adoptar la tecnología podrán guardar su material genético  en la UCN, y nosotros tenemos que dar la garantía que lo que eso involucra?, enfatizó Dupré.

Posteriormente este trabajo podría continuar en otras especies como salmónidos, donde existe amplio trabajo de líneas genéticas en nuestro país, ya que la criopreservación es la herramienta del futuro para la genética. Ello porque permite ahorro en los costos de mantención de los reproductores, permite realizar fecundaciones en cualquier momento del año (independiente de la época reproductiva). Además, permite la preservación del material genético por largos periodos sin disminución de su viabilidad, el uso de la totalidad de los espermatozoides disponibles, reducción del  riesgo de transmisión de infecciones y la posible producción de híbridos con características deseables para los cultivos. Junto con esto, evita el envejecimiento de los gametos y permite la conservación de la variabilidad genética para poblaciones domesticadas y especies en peligro.  



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